Protocolli diagnostici

Il 22 novembre 2014 è stato pubblicato in Gazzetta Ufficiale il decreto 7 ottobre 2014 di approvazione dei protocolli diagnostici "Protocollo di indagini e di riscontro diagnostico nella morte improvvisa infantile - Legge 2 febbraio 2006, n. 31, art.1, comma 2" e "Morte inaspettata di feto di età gestazionale superiore alla 25a settimana". Detti protocolli, elaborati da un apposito gruppo di lavoro, definiscono in modo particolareggiato tutte le tappe del riscontro diagnostico:

• indagine medico-legale

• autopsia

• diagnosi molecolare infettivologica

• accertamento tossicologico

• valutazione genetica

• consulenza genetica

• indagini citogenetiche

Considerato che la prevenzione si basa anche sulla migliore conoscenza delle alterazioni riscontrabili nei vari organi e sull’individuazione dei meccanismi che ne sono alla base, le attività di ricerca e prevenzione realizzabili attraverso l’applicazione dei due protocolli diagnostici si pongono come un’assoluta priorità di salute pubblica.

E’ quindi essenziale che i risultati delle indagini svolte secondo i due protocolli approvati, ma anche quelle effettuate nel corso di questi anni, siano comunicati tempestivamente (come previsto dell’articolo 3, comma 1, della legge citata) dai centri autorizzati alla banca dati nazionale istituita presso il Dipartimento di Scienze Biomediche, Chirurgiche e Odontoiatriche dell’Università degli studi di Milano, sede del Centro Lino Rossi, per consentire di comprendere e analizzare meglio questi eventi avversi. L’obiettivo è quello di ridurre i casi infausti ancora oggi senza spiegazioni e, una volta compresi tutti gli aspetti esaminati, abbassare il tasso di mortalità infantile ed evitare la sofferenza per le famiglie.

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Protocollo diagnostico per l’indagine neuropatologica in caso di morte improvvisa e inaspettata del feto e del lattante

Modalità di campionamento del tronco cerebrale

Dopo aver prelevato il tronco cerebrale dall’encefalo (dal mesencefalo all’inizio del midollo spinale) si procede alla fissazione in formalina. Al fine di esaminare i centri nervosi che sono indispensabili per lo svolgimento delle funzioni vitali non è necessario processare il tronco cerebrale per tutta la sua estensione ma è sufficiente eseguire dei prelievi mirati, come indicato nella Figura 1. Il primo campione si estende dal mesencefalo caudale (dal chiasma ottico) al terzo superiore del ponte, il secondo comprende essenzialmente la parte caudale del ponte e il terzo una porzione di midollo allungato che include l’obex (corrispondente al vertice inferiore del pavimento del quarto ventricolo). Un quarto campione include il limite inferiore del midollo allungato e la porzione rostrale del midollo spinale. In questi prelievi sono contenuti i principali nuclei le cui alterazioni possono essere coinvolte nel determinismo della morte improvvisa perinatale.

i campioni devono essere posti in contenitori separati, precisando sull'etichetta la sede del prelievo. La figura 2 schematizza le sezioni istologiche che si ottengono dai vari campioni con l’indicazione di alcune delle principali strutture che possono essere individuate.

Cervelletto

Per l’esame sia della corteccia cerebellare che dei nuclei (dentato, ecc.) prelevare un campione di emisfero per tutta l’estensione del diametro maggiore, come indicato nella figura 3.

Sistema di Conduzione Cardiaco

Prelievo del cuore

All'autopsia, il cuore è rimosso nel modo usuale, ma avendo massima cura nel recidere i grossi vasi in stretta vicinanza alle riflessioni del pericardio; in particolare, la vena cava superiore deve essere sezionata un paio di cm sopra il sacco pericardico, per assicurare l'esame del nodo seno-atriale possibilmente "alto”.

E' importante "salvare il pacemaker" evitando il consueto taglio del margine destro del cuore. Si esegue una incisione laterale verso la vena cava superiore senza resecare il ponte intercavale. Il taglio "cava-cava", infatti, taglierebbe diagonalmente il nodo SA, insieme alla cresta terminale. L'aorta va aperta sezionando la valvola aortica mitrale.

Rimozione dei campioni di miocardio specifico

Il sistema di conduzione cardiaco, sebbene costante per disposizione e struttura, è soggetto a notevoli variazioni individuali; pertanto, solo una osservazione istologica (con ricostruzione spaziale) su sezioni seriate ci permette di fornire i dati necessari sulla topografia e sulla patologia dei nodi e delle vie atrio-ventricolari (AV) specializzate.

I due campioni sono prelevati come segue:

Campione 1. Contiene il nodo seno-atriale (NSA), i suoi approcci atriali, la Crista Terminalis, i plessi gangliari del nodo seno-atriale. Il maggiore punto di repere per la sua rimozione è sostituito da Sulcus-Crista Terminalis. Due tagli longitudinali sono condotti paralleli alla linea del sulcus-crista, lungo la parete atriale, con un prolungamento mediale sul lato destro fino a raggiungere l'imbuto cavale superiore. Sul lato sinistro, si deve sezionare medialmente al ponte cava-cava, prolungando il taglio fino alla parete della vena cava superiore. Dei due tagli trasversali, quello superiore è indirizzato a rimuovere il più possibile l'imbuto cavale (tra le sezioni longitudinali), mentre quello inferiore rimuove, più o meno distalmente (a seconda del volume atriale), i muscoli pettinati che irradiano dalla Crista Terminalis.

Campione 2. Contiene la giunzione atrio-ventricolare (AV) con i suoi approcci atriali. I punti di repere sono, sul lato destro, lo sbocco del seno coronarico e la pars membranacea septi. Tenendo in mano il cuore, già aperto, esponendo il setto interventricolare contro una fonte di luce, si può osservare un'area trasparente rappresentata dalla pars membranacea septi. Tenendo ferma quest'area tra il pollice e l'indice, si procede a rimuovere il setto interventricolare insieme al corpo fibroso centrale, la parte inferiore del setto interatriale e gli adiacenti segmenti dell'anello fibroso AV. I tagli devono essere condotti come segue:

a) una incisione longitudinale inferiore attraverso la porzione posteriore del setto, attraverso l'anello AV, fino al margine superiore dell'ostio del seno coronarico;

b) una incisione longitudinale anteriore parallela alla precedente, attraverso la porzione superiore del setto, fino all'anello valvolare aortico;

c) e d) due incisioni perpendicolari a.) e b.), per rimuovere il blocco di tessuto, con il suo margine superiore (atriale-aortico) circa 1,5 cm sopra all'anello AV e il suo margine inferiore (apice ventriculare) passando intorno alla base del muscolo tricuspide mediale.

Dopo la sua rimozione, il blocco 2 può essere rifinito, rimuovendo i lembi e le corde valvolari e il tratto inutile della parete aortica e l'arteria polmonare, bene al di sopra della pars membranacea.

Entrambi i blocchi 1 e 2 vengono routinariamente fissati in formalina al 10% che, oltre alla semplicità, ha il vantaggio di permettere le tecniche istologiche di impregnazione argentica per le strutture nervose. Nelle inclusioni in paraffina, è consigliabile disporre in basso il margine mediale per il blocco 1 e il margine postero-inferiore per il blocco 2. Per il blocco 1 risulta un piano di sezione perpendicolare alla superficie atriale endocardica e parallela all'asse maggiore della Crista Terminalis. Per il blocco 2 risulta un piano di sezione perpendicolare a entrambe le superfici endocardiche, lungo il maggiore asse del setto.

SAN= nodo seno-atriale

NAV= nodo atrio-ventricolare

HB= fascio di His

BS= branca sinistra

BD= branca destra

R ATR= atrio di destra

R VENTR= ventricolo destro

L VENTR= ventricolo sinistro

Altri ricercatori hanno adottato una tecnica molto simile a quella sopra descritta per il prelievo del blocco 2, ma con ulteriore suddivisione di questo blocco in un certo numero di frammenti minori che sono inclusi e sezionati separatamente. Tale metodo ha il solo vantaggio di avere blocchi più piccoli da tagliare e più adatti al microtomo classico. Questo vantaggio ha però occasionali lacune sull'esatta estensione e disposizione delle lesioni del sistema AV ricostruito nello spazio, e sull’identificazione di vie accessorie mediate AV. Invero, è estremamente difficile, se non impossibile, ottenere sezioni dai differenti frammenti che coincidano l'uno con l'altro nelle tre dimensioni. Il numero delle sezioni seriate è variabile; in uno studio di routine una sezione ogni 100-150 µm.

Rimozione dei campioni per esame delle vie accessorie AV

Le vie accessorie mediate di tipo James e Mahaim, così come le vie dirette mediali (septo-septali) di Kent, sono reperibili nel blocco 2.

Processazione dei 2 campioni per lo studio del sistema di conduzione

A fissazione completata si procede alla disidratazione dei due blocchi. Esiste un rapporto preciso tra dimensione del campione e tempo di disidratazione. Per comodità abbiamo standardizzato questo processo che viene riassunto nel seguente schema della tabella 1.

Tabella 1

La rimozione della formalina avviene con acqua corrente per circa venti minuti, dopo di che si passa alla disidratazione tramite un passaggio in alcool etilico 95% per 24 ore e a quattro passaggi in 1-4 diossano puro (dietildiossido) per 12 ore cadauno. Segue una parziale impregnazione in una soluzione composta per 1/3 da diossano e per 2/3 da paraffina (punto di fusione 56-58°C) ed infine una totale impregnazione in paraffina pura (entrambi questi passaggi sono in stufa).

L’impiego del diossano è determinante per la tecnica del sistema di conduzione: il tessuto miocardico è piuttosto consistente: impiegando etanolo per la disidratatazione di questi blocchi essi si induriscono ulteriormente e tendono a "sbriciolarsi". Lo svantaggio risiede nel fatto che il diossano è tossico, va usato sotto cappa ed è molto più costoso dell’etanolo (circa 3 volte). Terminata la disidratazione si può procedere all’inclusione in paraffina con l’utilizzo di stampi metallici poiché i campioni sono fuori misura.

Inclusione in paraffina dei 2 campioni

L’inclusione deve avvenire secondo un preciso orientamento. Come si nota nella tabella 2 per il nodo seno-atriale (SAN) il punto di repere sono i muscoli pettinati che devono stare in alto. Per il nodo atrio-ventricolare (AVN) sono le valvole semilunari aortiche all’opposto della sezione di taglio. I blocchi così ottenuti vengono posti a raffreddare nel frigorifero.

Tabella 2

SAN= nodo seno-atriale

AVN= nodo atrio-ventricolare

Ogni inclusione viene previamente privata dello strato superficiale della paraffina e modellata nella sua parte superiore e sui lati in modo da limitare il più possibile la paraffina attorno al pezzo, per facilitarne il taglio al microtomo e la distensione della sezione nel bagno stendifettine.

L’inclusione viene fatta alta (circa cm. 4) per permettere alle morse del piano porta-inclusione del microtomo di avere una presa molto stabile, senza ricorrere a supporti lignei o metallici che il più delle volte si staccano.